子宫内膜癌是女性生殖系统常发生的恶性肿瘤之一，好发于围绝经期和绝经后女性。在我国，随着社会发展和经济条件的改善，子宫内膜癌的发病率亦逐年升高。白细胞介素17（IL-17或IL-17A）是由TH17细胞分泌的前炎症因子，具有促炎及抗炎双重作用。近年研究显示，IL-17作为重要的炎症因子在众多类型肿瘤中扮演重要角色，比如肠癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌等。子宫内膜癌的病因迄今尚不明确。本实验选择高分化的人子宫内膜样腺癌Ishikawa细胞，给予外源性IL-17A处理，通过细胞划痕实验检验IL-17A对Ishikawa细胞迁移的影响，并检测迁移相关蛋白MMP-9的表达，为探讨IL-17A在子宫内膜癌转移中的作用及其机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株
Ishikawa细胞株，为高分化子宫内膜样腺癌，ER、PR均为阳性，PTEN活性缺失，本实验室保存。
1.2 主要试剂与仪器
RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国，GIBCO公司），胰蛋白酶（美国，SIGMA公司），青链霉素双抗PS（美国，Hyclone公司）人重组IL-17A（美国，R&D公司），兔抗人MMP-7单克隆抗体、兔抗人MMP-9单克隆抗体（美国，Epitomics公司）。细胞培养箱（Thermo），Real-time PCR仪、Bio-rad MINI转移电泳仪、化学发光成像系统（美国，Bio-rad公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养
Ishikawa细胞细胞培养于60mm细胞培养皿中，含10%胎牛血清、1% PS的RPIM-1640培养基，放置于37°、5% CO2的培养箱中传代培养，每2～3天传代一次。用0.25%胰蛋白酶消化传代，细胞呈单层贴壁生长。
1.3.2 实验细胞分组与给药
将细胞分为对照组、IL-17A处理组。按1×105/孔将细胞接种于6孔板，培养24小时，待细胞达到90%以上融合，无血清培养20小时，然后用20ng/ml IL-17A处理细胞。
1.3.3 细胞划痕实验检测Ishikawa细胞迁移能力的变化
IL-17A处理细胞2h进行细胞划痕实验：用10μl枪头比着直尺，垂直于培养板划痕，用PBS洗涤细胞，以去除划下的细胞，洗涤3次之后加入无血清RPIM-1640培养基，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，分别于0、6、12、24h，显微镜下观察拍照。使用Image J软件打开图片后，随机划取6～8条水平线，计算细胞间距离的均值。每个时间长度细胞整体迁移的距离=每个时间点的距离长度-0h距离，求出均数和标准差，时间为横轴，迁移距离为纵轴（mm）作图，并比较初始0h与实验结束时试验组与对照组的照片。
1.3.4 Western-blotting检测MMP-7、MMP-9蛋白表达
分别于IL-17A处理细胞0h和24h，收集对照组和处理组细胞，每孔加入150μl细胞裂解液，充分裂解后提取总蛋白，nanodrop2000超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度，与样品处理液混合后煮沸10min，加样，每样品孔30ug，10% SDS-PAGE凝胶电泳，浓缩胶80V恒压电泳30min，分离胶140～180V，溴酚兰达凝胶底部停止电泳；半干转，恒压，20V、30min，将胶上的蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2h；MMP-7、MMP-9兔抗人单克隆抗体（1: 1000），4℃孵育过夜；TBST对膜进行清洗（15min，10min，10min），以洗掉非特异结合的一抗；HRP标记羊抗兔二抗（1:4000）室温孵育1h；TBST对膜进行清洗（5min×3）；采用ECL发光法显影，化学发光底物A液与B液1:1混合，室温避光反应5min，Biorad化学发光成像系统扫描图像，目的蛋白/GAPDH条带的灰度比值进行半定量分析。
1.3.5 细胞划痕实验检测Ishikawa细胞迁移能力的变化
两组细胞行划痕实验：用10μL枪头比着直尺，垂直于培养板划痕；用PBS洗涤细胞，以去除划下的细胞，洗涤3次之后加入无血清DMEM培养基；置于37°、5% CO2的细胞培养箱中培养；计算各组细胞迁移距离。
1.4 统计学处理
结果以3次重复实验所得的均数±标准差（x±s）表示，采用GraphPad Prism5 统计软件进行单因素方差分析，Tukey法进行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 外源性IL-17A对Ishikawa细胞迁移能力的影响
细胞于IL-17A处理2h行细胞划痕，分别于划痕后0h、6h、12h、24h拍照，检测各组细胞迁移能力的变化情况，可见IL-17A处理组细胞迁移能力增强，划痕6h、12h、24h迁移愈合距离均大于对照组，差异有统计学意义（表1，图1）。
2.2 2组细胞MMP-7及MMP-9蛋白表达
IL-17A处理细胞0h，2组细胞MMP-7及MMP-9蛋白表达均较低，差异无统计学意义；处理24h，IL-17A处理组MMP-7及MMP-9蛋白均高于对照组，差异均有统计学意义（图2）。
3 讨论
近年来，子宫内膜癌发生发展的免疫学机制在发病机制的探索中备受瞩目，寻找相关的免疫学因子显得尤为重要。T辅助淋巴细胞（T helper 17 cells，Th17）是近年来发现的可诱导组织发生强烈炎症反应的CD4+T细胞亚群，主要通过分泌IL-17募集中性粒细胞，引起炎症反应，在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等疾病中发挥重要作用。IL-17作为Th17细胞分泌的标志性细胞因子，具有促炎、抗炎的双重作用，在细胞增殖分化、生物因子转录、表达等方面发挥重要作用。
MMP-9又称92kDⅥ型胶原酶或明胶酶B，与多种肿瘤的侵袭转移表型关系最为密切，其主要作用底物是基底膜及细胞外基质中的Ⅵ型胶原、明胶、弹力蛋白等，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，在人肺癌、前列腺癌及黑色素瘤等的侵袭和转移中发挥重要作用。MMP-7又称作基质溶素，属于间质溶素类，主要作用于层粘连蛋白、纤维蛋白、蛋白多糖和核心蛋白，MMP-7还可以通过激活MMP-2和MMP-9来降解细胞外基质，进一步促进肿瘤细胞侵袭和转移，其作用在小鼠前列腺癌模型中得到了证实。本次研究发现，外源性IL-17A能够促进Ishikawa细胞的迁移，IL-17A处理组细胞高表达MMP-7及MMP-9蛋白，提示IL-17A可能通过上调MMP-7及MMP-9蛋白表达，促进Ishikawa细胞迁移。
参考文献
[1]Kolls JK，Linden A．Interleukin-17 family members and inflammation[J]．Immunity，2004，21（4）.
[2]Korn T，Bettell IE，Oukka M，et al．IL-17 and Th17 cells[J]．Annu Rev Immunol，2009，27（1）.
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[4]Zhang Q，Liu S，Zhang Q，et al．Interleukin-17 promotes development of castration-resistant prostate cancer potentially through creating an immunotolerant and pro-angiogenic tumor microenvironment[J]．Prostate，2014，74（8）.
收稿日期：2018-01-04
作者简介：魏敏（1996-），女，江苏赣榆人，就读于华北理工大学临床医学院，研究方向：糖尿病的发病机制与药物治疗。魏静波为通讯作者。
