脱氧核糖核酸，也称去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid-DNA），属于一种生物大分子，储备着生物体赖以生存、繁衍的遗传信息，对生物发育、生命机能运作起到重要的引导作用。通常情况下，外界环境、生物体内部的温度、重金属、辐射等因素均会导致DNA损伤而产生致死性、丧失某些功能等不良后果。因此，维护DNA的完整性对细胞至关重要。羟基自由基（-OH）是一种活性氧，与机体所有细胞成分均可发生反应，一旦自由基过多，便会损伤机体，以-OH引起DNA的碱基、脱氧核糖产生化学变化，导致碱基脱落、脱氧核糖分解等不良后果。现阶段，针对光照激发光催化作用介导产生-OH引起DNA损伤机制的相关研究报道较少。基于此，本文以鲱鱼精DNA施以紫外光激发TIO2的光催化作用介导产生的-OH为基础，全面分析-OH、DNA两者的相互作用原理，以便了解-OH引起的DNA损伤的发生机制，分析如下。
1 资料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
德国Brucker公司提供的ESP300E波谱仪、北京市六一仪器厂提供的GE-100凝胶电泳仪、美国Waters公司提供的600E-SOLVENT高效液相色谱仪。
1.1.2 试剂
10.0mg/L8-羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）溶液、10.0g／L N，N-二乙基对苯二胺（DPD）溶液、0.4mol/L5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）溶液、1.0g/L辣根过氧化物酶（POD）溶液、1.0.0mg／L鲱鱼精DNA水溶液。甲醇是色谱级。
1.2 方法
准备圆柱型硬质石英瓶，将10mg／L鲱鱼精DNA、1.0g／LTiO2置入瓶内，于暗处进行搅拌4小时，促使DNA吸附平衡在催化剂表面，计时，引人紫外光，间时留取样本予以分析，设Dark/TiO2、单纯UV为对照。在相同条件下调整不同底物pH、TiO2浓度，对影响光催化损伤DNA因素予以全面探究。
电泳分析：条件为电压101V、电流80mA、琼脂糖凝胶（1％正常熔点）、电泳时间0.5h，以凝腔成像系统利用中波302nm分析琼脂糖凝。
高效液相色谱分析：KromasilC18色谱柱、检测波长260nm、甲醇-0.05％醋酸钠溶液（流动相）、流速为0.5mL/min，自旋捕获剂为5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）溶液，直接在水相中捕捉自由基生成DMPO-OH加和物，利用电子自旋共振、分光光度法分别测定DNA损伤过程-OH、H20相对浓度变化。间时留取1mL样本，放在装有H2O2测定液的比色管内，定容，静置10min，进行离心处理，收集上清液，对其利用波长510nm予以检测。以HJ/L399-2007为依据，分析DNA损伤过程化学需氧量变化。
2 结果与讨论
2.1 DNA损伤的电泳分析
电泳图谱内DNA的3种形态（超螺旋、开环、线性）分布可有效反应DNA损伤程度，通过凝胶电泳检测DNA损伤程度，可得DNA片段随着光催化辐照时间延长而减少，致使DNA氧化损伤加重，特别是UV/TiO2，当辐照DNA3h，无SC DNA、L DNA、OCDNA形态，说明DNA完全损伤。
2.2 分析DNA色谱图
以高效液相色谱分析DNA色谱图1（a），随着辐照时间延长，10.4min的DNA峰面积呈缩小趋势。40min样品出现损伤产物峰，并且其面积随辐照时间延长呈先增后减变化。通过将8-羟基脱氧鸟苷作为内标物，证实DNA损伤中间产物是8-羟基脱氧鸟苷，因此，将DNA峰面积、8-羟基脱氧鸟苷峰面积进行辐照时长作图，见图1（b）。
（a）DNA损伤过程色谱图 （b）DNA损伤与其损伤产物动力学曲线
图1
DNA氧化损伤严重程度依次是UV/TiO2、UV、Dark／Ti02，说明UV/TiO2的DNA氧化损伤度较重，当辐照1.5h，损伤可达99%，以8-OHdG浓度最高为损伤产物，其属于先生成后消失物质，是一种DNA氧化损伤的中间产物。当pH值接近中性，光催化引起DNA损伤程度最重，见图2（a）；当TiO2浓度处于1.5g/L且辐照时长0.5h，DNA损伤程度为30%，光催化对DNA损伤程度最显著，见图2（b）。可知，DNA浓度、Ti02浓度分别处于10mg/L、1.5g/L且Ti02PH为7～8时，可显示出最高的光催化反应效率，进而DNA损伤严重。
（a）不同底物pH、TiO2浓度 （b）影响光催化产生的DNA氧化损伤
图2
2.3 DNA损伤期间的氧化物、H2O2相对浓度
经分析，UV、Dark/TiO2体系无H2O2产生且DNA未出现损伤，见图3（a）。当在此体系内引入紫外光、催化剂，产生大量H2O2且在反应8h浓度最高，随着辐照时间延长，其被紫外光分解，形成-OH。通过电子自旋共振对不同体系生成的-OH波谱信号予以检测，加以UV/TiO2对其辐照，可得强度为1:2:2:1的四重峰，说明-OH生成，见图3（b）。由此可知，UV/TiO2光催化作用介导会促进大量H202、-O的生成，体现出DNA氧化损伤过程存在-OH氧化。
（a）DNA氧化损伤期间的H202相对浓度变化 （b）UV／Ti02体系DMPO-OH加合物的ESR波谱信号
图3
2.4 -OH引起DNA损伤的机制
经过上述分析，可以发现紫外光通过激发TiO2光催化作用，可以产生-OH（氧化能力较强），其可以诱导DNA发生氧化损伤。鸟嘌呤是一种有机化合物，以嘌呤核苷酸形式存在，是-OH攻击DNA结构氧化损伤的首要位点，最终产生8-羟基脱氧鸟苷，即特异产物。可得，DNA损伤进程分析如下：鸟嘌呤发生自身氧化反应而转变成不稳定的鸟嘌呤基团，结合空气内氧、H+形成R-OOH，跟随体系重排反应，生成8-氧脱氧鸟嘌呤；紫外光激发TiO2介导产生-OH，其会促使8-氧脱氧鸟嘌呤发生氧化而生成8-羟基脱氧鸟苷；加上光催化反应，8-羟基脱氧鸟苷经-OH作用，逐渐氧化成小分子无机物，如CO2、H2O等。
参考文献
[1]由超．人源DNA聚合酶Polδ最小亚基p12及相关蛋白在DNA损伤和细胞凋亡过程的调控分析[D]．镇江：江苏大学，2015.
[2]吴丽丹．DNA氧化损伤动力学机理研究：自由基反应及单电子氧化/脱质子反应[D]．北京：中国科学院大学，2015.
[3]李洪亮，周漫，丁冶春，等．六月雪水提取物体外清除羟自由基活性的实验研究[J]．赣南医学院学报，2016，36（1）.
（作者系湘南幼儿师范高等专科学校高级讲师）
