0 引言
苦瓜，是常见葫芦科一年生蔓性草本植物，全球种植面积广阔，药用价值极高，其果实因易生成活性化合物而不易受害虫侵扰。鉴于小菜蛾对常态杀虫剂抗性增强，亟需性能高效且安全低毒的新型生化制剂，本文将聚焦苦瓜果实提取物对小菜蛾幼虫的拒食活性，分离并鉴定出苦瓜果实提取物中的活性成分，进一步积累抑制小菜蛾幼虫取食活动的研究经验。
1 材料与方法
1.1 一般性材料
本文所选苦瓜果实来自某科学试验农场，洗净晾干烘烤后碾成粉末。主要使用的化学试剂包括工业用95%乙醇溶剂，用作苦瓜果实活性成分提取；分离纯化试剂正丁醇（CH3(CH2)3OH）、乙酸乙酯（CH3COOC2H5）、甲醇（CH3OH）、氯仿（CHCl3）、石油醚等；柱层析用硅胶等。所有化学试剂均为合法正规渠道购得，为化学纯试剂。研究所用小菜蛾幼虫取自某科学实验农场未施药菜地，以幼虫或虫蛹状态饲养至成虫，待产卵后饲养1~2代，控制种群繁衍数量，选用2、3龄幼虫供本实验用。叶碟选用甘蓝菜叶。
1.2 苦瓜果实提取物制备
将已备粉末状苦瓜果实，放入乙醇连续浸泡4次，总时长4×24h，滤渗残液后收集合并，经仪器浓缩后得到膏状苦瓜果实乙醇浸提物。提取物先后经石油醚有机溶剂、CH3COOC2H5、CH3(CH2)3OH依次完成萃取，每次保留上层清液为当前萃取层，从而得到石油醚萃取物、CH3COOC2H5萃取物、CH3(CH2)3OH萃取物及最终残渣，分别经仪器浓缩后得到膏状物质并置于低温保存。
取实验CH3COOC2H5萃取物，以CH3OH溶解并与硅胶拌匀后粉碎晾干备好硅胶柱，先以石油醚有机溶剂进行硅胶柱层析，以CH3COOC2H5组分为样品，用液相石油醚有机溶剂对样品进行冲洗，待样品色素淡化转白后，将石油醚有机溶剂与CH3COOC2H5溶剂按不同梯度配比完成配液进行硅胶柱层析。然后按等量的CH3COOC2H5与CHCl3物质配液进行硅胶柱层析，出现沉淀后将CHCl3与CH3OH按不同梯度配比完成配液实施柱层析。用纯CH3OH溶剂冲洗硅胶柱，得到9组分溶剂待实验分析用。本文中的次生化合物是由9组分溶剂其中的3个活性组分重结晶得到。
1.3 小菜蛾幼虫的拒食活性测定
以下测定试验均以叶碟法为基本思路，规范制作甘蓝叶叶碟后实施试验及测量。叶碟要在不同试液中接受不同浓度的试液浸泡，进行选择性试验，并用九宫方格图板对试虫取食叶碟面积进行测量。各浸泡试液的具体操作如下：
（1）苦瓜乙醇提取物的拒食作用测定。稀释10000µg/ml乙醇提取物，分3个浓度梯度4000µg/ml、1000µg/ml、250µg/ml浸泡。
（2）苦瓜乙醇提取物及其他萃取物的拒食活性测定。取同等浓度3000µg/ml的不同萃取物试液浸泡。
（3）乙酸乙酯萃取物不同浓度对小菜蛾幼虫拒食作用的测定。取250µg/ml、1000µg/ml、4000µg/ml等试液浓度浸泡。
（4）苦瓜乙酸乙酯萃取物柱层析9个组分的拒食活性测定。取同等浓度1000µg/ml的不同层析组分试液浸泡。
在（4）操作完成后，测定苦瓜乙酸乙酯萃取物柱层析组分重结晶的次生化合物的拒食活性。取1000µg/ml的化合物，组织选择性试验。另外，对于重结晶次生化合物G的拒食持效性测定，取1000µg/ml稀释为1000µg/ml、500µg/ml、250µg/ml，以CH3OH为对照，实施必要的选择性试验，间隔24h清查测算一次取食叶碟面积，对照与处理对象之间差异消除后结束试验。
2 结果与分析
2.1 苦瓜果实乙醇提取物对小菜蛾幼虫的拒食活性
试验中，苦瓜果实乙醇提取物对小菜蛾2龄、3龄幼虫均能分别体现明显的拒食作用。可从试验结果的拒食率比值中分析得出。如表1~表2所示。
2.2 不同萃取物对小菜蛾幼虫的拒食活性
CH3COOC2H5萃取物、CH3(CH2)3OH萃取物均在3000µg/ml浓度下对小菜蛾2龄幼虫的取食行为有抑制作用。选择性试验条件下，处理24h后对应萃取物拒食率分别为56.38%和35.86%；处理48h后，拒食率对应变为55.68%和37.89%。各萃取组分中以CH3COOC2H5萃取物的活性最高。
2.3 CH3COOC2H5萃取物对小菜蛾幼虫的拒食活性
与其他萃取物相比，苦瓜果实乙醇提取物的CH3COOC2H5萃取物对小菜蛾幼虫取食抑制作用最好，因此选CH3COOC2H5萃取物进行下一步试验，进一步跟踪苦瓜果实活性物质。
2.4 CH3COOC2H5萃取物的柱层析产物对小菜蛾幼虫的拒食活性
通过上述试验可知苦瓜果实活性物质确存在于CH3COOC2H5萃取物中，将后者胶柱层析得到层析产物F1~9。其中F1、F2、F5、F7这4组分在选择性试验条件下对小菜蛾2龄幼虫都有拒食作用。F1、F2、F7可重结晶得到化合物A、B、G，在1000µg/ml恒定浓度中对小菜蛾幼虫有拒食作用。选择性试验条件下处理24h后，化合物A、B、G对2龄幼虫的拒食率分别为32.80%、50.35%、51.61%；处理48h后，拒食率分别为31.58%、49.83%、55.55%；化合物A、B、G对小菜蛾3龄幼虫同样表现出较强拒食作用，选择性试验条件处理24h后，化合物A、B、G的拒食率依次为14.04%、18.54%、50.35%；处理48h后拒食率分别为21.01%、21.79%、37.35%。
2.5 苦瓜次生化合物G对小菜蛾的拒食活性与持效性
处理48h后，选择性试验条件下，250µg/ml浓度下的化合物G能抑制小菜蛾2龄、3龄幼虫的取食；在1000µg/ml浓度下，化合物G在5d内对小菜蛾2龄、3龄幼虫都有拒食作用。
3 讨论
本文中，苦瓜果实乙醇提取物能够对小菜蛾2龄、3龄幼虫的取食行动产生明显的抑制与忌避效果。苦瓜果实乙醇提取物经过处理得到的不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物的活性最大，其浓度越高，拒食率也相应抬升。苦瓜果实的乙酸乙酯萃取物的硅胶柱层析9个组分中，1、2、5、7组分会对小菜蛾2龄幼虫产生显著的拒食活性。其中1、2、7组分重结晶次生化合物A、B、G，能够对小菜蛾2龄、3龄幼虫产生显著拒食活性。化合物G不仅拒食活性极高，而且具有较长的持续性，能够在1000ug/ml的浓度基础上持续限制小菜蛾2龄、3龄幼虫的进食行为，随后在时间延长过程中因浓度降低而拒食率随之减小。
参考文献
[1]骆清兰．苦瓜提取物对小菜蛾取食和产卵的抑制作用[D]．广州：华南农业大学，2007．
[2]陈剑超，刘接卿，程保辉，等．苦瓜的化学成分与生物活性研究[C]．全国药用植物及植物药学术研讨会，2011．
[3]凌冰，王国才，轧霁，等．苦瓜叶提取物对小菜蛾的拒食活性及有效成分研究[J]．中国农业科学，2008（10）：3116-3122．
收稿日期：2018-12-17
作者简介：骆清兰（1981-），女，广东河源人，供职于深圳市龙华区动植物检验检测中心，中级，硕士，研究方向：农产品质量安全监管。
