鸦胆子油乳注射液无菌检查方法适用性试验

《中国药典》（2015年版）规定，进行产品无菌检查时应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。鸦胆子油乳注射液为抗肺癌、肺癌脑转移及消化道肿瘤药，该产品为鸦胆子油经精制豆磷脂乳化所得的水包油型乳剂。为了确保临床用药安全，需对其进行无菌检查。本文用薄膜过滤法对3批鸦胆子油乳注射液进行无菌检查方法适用性试验，确保了鸦胆子油乳注射液无菌检查的检验条件和方法。

1　验证材料

1.1　仪器

HTY-602集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司），一次性全封闭集菌培养器（EVS301，杭州泰林生物技术设备有限公司），GHP-9270隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），LRH-250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），MJ-250-II霉菌培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），YG-0.25脉动真空灭菌柜（江苏神农灭菌设备有限公司），DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），SW-CJ-2FD双人单面超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），BSC-1300IIA2生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2　方法适用性试验用菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44102]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]；生孢梭菌[CMCC（B）64941]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉[CMCC（F）98003]（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌菌种均从中国食品药品检定研究院购买0代冻干粉；黑曲霉菌种从广东环凯微生物科技有限公司购买0代冻干粉；江苏九旭药业有限公司生测室岗位人员将0代冻干粉复溶后，自行制备斜面；其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌为第三代；生孢梭菌、白色念珠菌为第二代；黑曲霉为第四代）。

1.3　培养基及冲洗液

硫乙醇酸盐流体培养基（批号：150605）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：1701182）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：1704142）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：170509）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：150914）、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（批号：160801），以上培养基均来源于北京三药科技开发有限公司。

1.4　试药

鸦胆子油乳注射液（规格：20mL，批号分别是20170708、20170709、20170710），由江苏九旭药业有限公司生产。

2　方法与结果

操作应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求。应在B级背景下的A级单向流洁净区域中进行。

2.1　菌液制备

（1）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的斜面培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，30℃～35℃培养18～24h；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成小于100CFU/mL的菌悬液。

（2）生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物，取其培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成小于100CFU/mL的菌悬液。

（3）白色念珠菌斜面接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20℃～25℃培养24～48h，取其培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成小于100CFU/mL的菌悬液。

（4）取20℃～25℃培养5～7d的黑曲霉的斜面，加3～5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱制成小于100CFU/mL的孢子悬液。

（5）菌液计数。分别取上述4种适宜稀释级别的细菌菌液1mL加入培养皿，每种菌液做平行2皿，注入胰酪大豆胨琼脂培养基，置30℃～35℃培养48h计数，其中生孢梭菌放置厌氧罐培养。分别取上述2种适宜稀释级别的真菌菌液1mL加入培养皿，每种菌液做平行2皿，注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，置20℃～25℃培养72h计数。

2.2　方法适用性试验

2.2.1　试验组

按照《中国药典》2015年版四部通则1101无菌检查薄膜过滤法进行过滤，取每批供试品30支，即抽取20mL/支供试品注入培养器内，全部供试品抽取后，抽取少量冲洗液冲洗管路，然后将滤器中的样品过滤至尽；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500mL（1瓶）按不少于3次平均分配进行冲洗，冲洗完成后，灌注硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基，吸取上述制备好的菌液1mL分别接种至各自培养基中。

2.2.2　供试品对照组

方法同试验组，但不加各试验菌液。

2.2.3　阴性对照组

冲洗方法同试验组，但不加供试品。

将上述培养基置于规定温度下培养，供试品对照组和阴性对照组培养14d，试验组培养3～5d，并逐日观察。试验结果见表1和2。

供试品对照组和阴性对照组14d逐日观察均为阴性。

表1　方法适用性试验用菌液的稀释级别及菌落数

表2　方法适用性试验结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

2.3　结果

经过3次平行试验，采用薄膜过滤法，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为冲洗液，即抽取20mL/支供试品注入培养器内，全部供试品抽取后，抽取少量冲洗液冲洗管路，然后将滤器中的样品过滤至尽；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500mL（1瓶）按不少于3次尽量平均分配进行冲洗，各试验菌均在规定时间内长势良好，并与菌液组中相应的菌落生长情况一致，供试品对照组和阴性对照组均无菌落生长，故可采用薄膜过滤法用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为冲洗液对鸦胆子油乳注射液进行无菌检查。

3　讨论

3.1　关于集菌培养器的选择

本品为水包油型乳剂，初步试验时采用了APY330及其改进型集菌培养器，但是样品抽滤至一半时就出现压滤甚慢或集菌培养器红色盖帽蹦出（集菌培养器内部压力太大）的现象，导致批检验过程长达1.5h，效率低下且染菌风险增加，过滤后也会出现滤膜变形等现象，严重影响了检验结果和最终判断的准确性。经集菌培养器生产厂家和我公司反复试验，最后确定选用EVS301型集菌培养器。

3.2　关于冲洗液

确定采用EVS301集菌培养器后，选用了0.1%蛋白胨水溶液、0.1%蛋白胨水溶液（含0.1%吐温80）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（含0.1%吐温80）作为冲洗液，在压滤冲洗上没有明显异常，依据操作人员的反馈及可操作性，并结合培养观察结果的准确性，最终采用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为冲洗液，确定冲洗液及集菌器型号后，批检验时间缩短至30分钟以内。

综上，该方法适用性试验表面薄膜过滤法可以快速、准确地用于鸦胆子油乳注射液的无菌检验。

参考文献

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典[M]．北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]国家药典委员会．中国药典分析检测技术指南[J].中国医药科技出版社，2017，（7）.

[3]宋萍，章燕君，何萍，等．鸦胆子油乳注射液的临床药物利用研究[J]．中国医药指南，2013，11（27）.

（作者陈应林系浙江九旭药业有限公司高级工程师）