自发性Ⅱ型糖尿病db/db小鼠肝脏生物学特性分析

糖尿病是严重威胁人类身心健康的慢性终身代谢性疾病，是一种发病率高、并发症多、治疗周期长的综合慢性病，需要终身治疗。我国已成为全球糖尿病患者人数最多的国家，对国家和个人造成沉重的经济负担。而II型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）又占糖尿病的95%，其病理生理特征为胰岛β细胞功能失调和胰岛素抵抗，胰岛素相对不足。在糖尿病有效药物的开发过程中，研究人员首先利用糖尿病动物模型评价药物的安全性和有效性，因此，持续、稳定的动物模型对于寻找治疗药物及发病机制研究非常重要。db/db小鼠是一种Leptin受体基因缺陷导致的自发性II型糖尿病小鼠，具有高血糖、高血脂、胰岛素敏感性下降、胰岛素抵抗等特性，其发病过程与人T2DM非常相似。本文主要针对db/db小鼠血糖、肝脏部分血生化以及病理改变进行研究，为利用db/db小鼠寻找T2DM的有效药物提供基础数据。

1　材料与方法

1.1　实验动物

SPF级db/db小鼠18只（体重30～40g，8周龄，雌雄各半）；SPF级db/m小鼠18只（体重18～22g，8周龄，雌雄各半），购于常州卡文斯实验动物有限公司（SCXK（苏）2001-0003；20151030001MF01）；饲养于华北理工大学B区实验动物中心屏障环境中，不限食水，其中饲料为60Co辐射小鼠颗粒饲料（南京贝斯弗饲料有限公司，生产批号：20151030001MF01）。

1.2　主要试剂及仪器

AST以及ALT试剂盒（北京瑞正善达生物工程技术有限公司）；全自动生化检测仪（RT200C美国）。

1.3　实验动物分组

SPF级db/db小鼠经缓冲间适应性隔离饲养后进入SPF级屏障环境中，7天后测定随机血糖（剪尾法），选取血糖＞16.7mmom/L作为糖尿病模型组，对照组为SPF级db/m小鼠。

1.4　检测指标

实验动物经剪尾法测定随机血糖，麻醉后摘眼球取血，室温自然凝固，备用；动物脱颈椎处死，预冷生理盐水灌注冲洗后用冷多聚甲醛灌注固定，取肝脏组织HE染色，高倍光镜下观察肝脏病理变化。备用血清分层后取上层血清，检测AST、ALT、TG及CHO水平。

1.5　数据处理

采用SPSS17.0统计软件进行数据处理；计量资料以`x±s表示；组间比较采用单因素方差分析；定义p＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　随机血糖结果

与对照组db/m小鼠（雌、雄）相比，db/db小鼠（雌、雄）血糖显著升高且雄性小鼠血糖升高水平更显著。

表1　db/m小鼠与db/db小鼠随机血糖结果（`X±s，n=9）

注：*p＜0.05，p＜0.005 vs db/m。

2.2　肝脏血清学结果

与对照组雌性db/m小鼠相比，雌性db/db小鼠AST、ALT、CHO水平显著升高，TG无显著变化；与对照组雄性db/m小鼠相比，雄性db/db小鼠ALT、CHO水平显著升高，AST数值上升较大，但无统计学意义；TG数值轻度上升亦无统计学意义。

表2　db/m小鼠与db/db小鼠肝脏血清学结果（`X±s，n=9）

注：*p＜0.05，p＜0.005 vs db/m。

2.3　肝脏病理染色结果

HE染色结果显示，db/m小鼠（对照组小鼠，雄性）肝小叶结构清晰，挑唆结构正常，如图1-A、图1-B所示；而db/db小鼠（雄性）肝脏细胞索排列紊乱，细胞发生脂肪变性，表现为空泡状，形似脂肪细胞，呈气球样变，如图1-C、图1-D所示。

图1　db/m小鼠与db/db小鼠肝脏病理染色结果

3　讨论

db/db小鼠模型是leptin-receptor-deficient引起的自发性糖尿病动物模型，与ob/ob小鼠、肥胖Zucker大鼠（fa/fa）、Wistar Kyoto大鼠（fa/fa）和KO小鼠（去除insulin receptors or glucose transporter 4基因的小鼠）同为用于研发治疗T2D药物常用的5种动物模型，也是FDA推荐的动物模型。db/db小鼠模型的特点有胰岛素抵抗、胰岛素敏感性下降、高胰岛素、高血糖等特点，和人类2型糖尿病病理特点很近似，基本可以反映出人类疾病的特点，对糖尿病的药物筛选和研发保健成功和动物模型有很大关系。

db/db小鼠模型模拟高血糖病人体内代谢情况，因胰岛素抵抗在胰岛素分泌量绝对增多的情况下，肝脏合成的糖原依旧过量，影响肝功能。在相同饲养条件下，与db/m小鼠相比，db/db小鼠血糖水平显著升高，肝功能受损，表现为ALT水平显著增高。其中雌性db/db小鼠AST亦显著升高，雄性小鼠AST数值升高，但是无显著性差异。ALT是诊断肝细胞实质损伤的主要项目，主要分布在肝细胞浆，其升高显示肝细胞膜受损；AST主要分布在细胞器如肝细胞浆和肝细胞线粒体中，其显著升高提示肝细胞受损更加严重，已累及细胞器水平。此结果显示，db/db小鼠的肝损伤已经开始步入细胞器损伤阶段，高糖环境对db/db小鼠的肝脏损伤严重。T2MD在高血糖的同时往往伴有脂质代谢紊乱，故本文在考察高血糖对db/db小鼠肝功能损伤的同时测定TG及CHO的含量。实验结果显示，与db/m小鼠相比，db/db小鼠CHO显著升高，TG数值升高（但无统计学意义），提示db/db小鼠脂质代谢出现紊乱，与T2MD发病相符。

本文实验结果提示，db/m小鼠能够很好地模拟T2MD肝脏损伤，是一种适用的T2MD

模型。

参考文献

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收稿日期：2018-03-08

作者简介：高玲焕（1982-），河北唐山人，供职于华北理工大学基础医学院，研究方向：代谢性疾病及神经退行性疾病。柳月娟（通讯作者）（1983-），河北唐山人，供职于华北理工大学中医学院，研究方向：代谢性疾病及神经退行性疾病。

基金项目：河北省中医药管理局科学研究计划项目（2018175）；华北理工大学2015年博士启动基金（28762999）；河北省自然科学基金青年科学基金（H2018209260）。